Ujian PCR
Maximilian Reindl belajar kimia dan biokimia di LMU di Munich dan telah menjadi ahli pasukan editorial sejak Disember 2020. Dia akan membiasakan diri dengan topik perubatan, saintifik dan kesihatan untuk anda agar mereka dapat difahami dan difahami.
Lagi catatan oleh Maximilian Reindl Semua kandungan diperiksa oleh wartawan perubatan.Ujian PCR telah menjadi bahagian yang sangat diperlukan dalam perubatan moden dan diagnostik molekul. Kerana sangat tepat, mereka dianggap sebagai "standard emas". Mereka dapat digunakan dalam berbagai aplikasi, dari pengesanan patogen hingga pemeriksaan penyakit keturunan - yaitu di mana pun diperlukan untuk mengesan dengan pasti bahkan jejak terkecil dari bahan keturunan. Ketahui di sini mengapa ujian PCR begitu tepat, di mana ia digunakan dan bagaimana ia berfungsi secara terperinci.
Apakah ujian PCR?
Ujian PCR adalah kaedah makmal dari biologi molekul dan perubatan. Ujian ini digunakan untuk pengesanan langsung - dan pencirian - bahan genetik. Kaedah PCR dianggap oleh para pakar mudah dijalankan, berlaku secara universal dan mantap.
Di makmal, ujian PCR terdiri daripada dua langkah. Pada langkah pertama, bahan genetik yang ada dihasilkan semula dengan bantuan tindak balas rantai polimerase, atau PCR. Dengan cara ini, jejak DNA terkecil dapat diperiksa. Ini juga merupakan sebab mengapa ujian PCR begitu sensitif.
Pada langkah kedua, bahan genetik dipisahkan, "disusun" dan dicirikan mengikut sifatnya. Jadi struktur halus DNA ditentukan.
Terdapat banyak kemungkinan penggunaan: Doktor menggunakan ujian PCR untuk memeriksa, misalnya, smear untuk coronavirus, derma darah untuk HIV atau menyaring bayi yang baru lahir untuk kemungkinan penyakit keturunan. Jangkitan bakteria - misalnya dengan patogen tuberkulosis - atau jangkitan parasit (malaria) juga dapat diperjelaskan dengan PCR.
Mereka juga membantu dalam perubatan forensik untuk menghukum pesalah berdasarkan cap jari genetik mereka atau digunakan sebagai ujian ayah.
Semua aplikasi ini diringkaskan di bawah istilah diagnostik molekul. Oleh itu, PCR menemui aplikasi praktikal dalam penyelidikan, diagnostik dan forensik yang jauh melebihi pengesanan patogen Sars-CoV-2.
(Corona) Ujian PCR berbanding ujian PCR pesat
Biasanya, penilaian ujian PCR dilakukan di makmal khusus. Ini bermaksud bahawa bahan sampel dihantar dan diperiksa di sana. Hasilnya biasanya diterima beberapa hari kemudian.
Pelbagai permulaan (GNA Biosolutions, Spindiag) baru-baru ini membentangkan jenis alat ujian mudah alih baru. Untuk ini, mereka juga mendapat kelulusan khas dari Institut Dadah dan Alat Perubatan Persekutuan (BfArM). Dengan bantuan alat ujian PCR mudah alih ini, ujian PCR juga dapat dilakukan tanpa makmal khusus.
Pendekatan ini berpotensi besar, kerana hasil ujian yang dapat dipercaya dapat tersedia dalam beberapa jam langsung di lokasi pengambilan sampel (pusat ujian).
Sejauh mana sistem ujian PCR yang cepat ini berlaku dalam praktiknya belum dapat dinilai. Juga belum diketahui seberapa cepat pusat ujian akan dibekalkan dengan alat-alat ini secara menyeluruh.
Untuk masa yang akan datang, ujian PCR berasaskan makmal "biasa" akan terus dilakukan, yang menyebabkan kelewatan tertentu antara pengambilan sampel dan hasil ujian.
Sejauh mana ujian PCR boleh dipercayai?
PCR adalah kaedah pengesanan yang terbukti dalam diagnostik dan perubatan molekul. Ia dianggap standard emas yang disebut dengan kadar kesalahan yang sangat rendah. Ujian ini dicirikan oleh kepekaan dan kekhususan yang sangat tinggi.
Sensitiviti bermaksud kebolehpercayaan yang mana ujian mendapati bahan genetik dapat dikesan.
Kekhususan bermaksud kepastian yang dengannya ujian menentukan bahawa bahan genetik yang dimaksudkan tidak terdapat dalam sampel.
Bilakah ujian PCR berfungsi sekiranya berlaku jangkitan Sars CoV-2?
Sebagai peraturan, ujian PCR mengesan jangkitan korona dua hingga tiga hari sebelum dan hingga 20 hari setelah timbulnya gejala. Walaupun dengan orang yang dijangkiti yang masih bebas dari gejala, ujian ini dapat dijalankan dalam jangka masa kritikal apabila mereka dapat menjangkiti orang lain.
Dalam kes individu, bukti ini mungkin berlaku 60 hari selepas gejala penyakit muncul.
Pada hari pertama setelah jangkitan korona, ujian PCR juga boleh menjadi negatif, walaupun terdapat jangkitan. Dalam kes seperti itu, tidak terdapat cukup virus di kerongkong pada masa ujian smear. Namun, jika terdapat kecurigaan jangkitan, doktor biasanya melakukan ujian PCR lain pada hari-hari berikutnya.
kemungkinan sumber ralat
Amalan kesalahan dalam proses penyalinan DNA dipraktikkan. Walaupun polimerase DNA tidak pernah berfungsi dengan baik, mereka tidak berperanan dalam proses ujian PCR.
Dalam praktiknya, kemungkinan sumber ralat terletak pada proses pensampelan: Oleh itu, penting bahawa kakitangan perubatan terlatih melakukan pemburuan. Sampel air liur dan berkumur mungkin dapat mengurangkan ketepatan, kerana kesan pencairan berlaku di sini.
Bagaimana ujian PCR berfungsi?
Ujian PCR dijalankan, misalnya, oleh doktor keluarga atau di pusat ujian khas. Pertama, doktor atau profesional kesihatan terlatih mengambil contoh. Biasanya, penyapu diambil dari saluran udara atas untuk ujian. Ini biasanya mengambil bentuk mulut atau hidung dan swab tekak.
Berkumur dengan larutan bilas juga boleh dilakukan. Sampel darah tidak biasa untuk pengesanan korona - tetapi tersebar luas, misalnya, dalam pemeriksaan bayi baru lahir.
Terlepas dari jenis sampel yang diambil, bahan genetik terdapat pada kapas, dalam larutan pembilasan atau setetes darah. Bahan sampel ini dihantar ke makmal, di mana ia diasingkan dan disucikan.
Ujian PCR kemudian dibahagikan kepada dua langkah:
- PCR: Dalam langkah ini, jumlah bahan genetik asal digandakan.
- Elektroforesis: Pada langkah kedua, segmen genom "disusun" mengikut ukuran. Dengan cara ini, sampel dapat dicirikan - struktur halus bahan genetik ditentukan.
Langkah 1: PCR - "Tindak balas rantai polimerase"
"PCR" adalah yang pertama dari dua langkah kerja: Di sini jumlah DNA permulaan yang ada digandakan. Kerana hanya apabila bahan genetik tersedia dalam kuantiti yang mencukupi dapat dikaji. Sebilangan besar ini adalah DNA manusia; ujian untuk coronavirus adalah RNA virus.
Singkatan PCR adalah singkatan dari istilah Inggeris "Polymerase Chain Reaction".
Apa yang diperlukan untuk PCR?
DNA permulaan terletak di dalam kapal reaksi dengan bahan khas. Bahan genetik yang ada berfungsi sebagai templat, yang disalin dengan adanya enzim tertentu (Taq polymerase) dan blok asas DNA tertentu.
Proses penyalinan berlaku dalam beberapa - pengulangan berulang (kitaran).
Secara khusus, bahan berikut digabungkan:
- Memulakan DNA: bahan sampel yang akan ditiru.
- Blok asas DNA asas: Ini adalah nukleobase adenin, timin, sitosin dan guanin.
- DNA polimerase: Enzim yang menghubungkan blok bangunan DNA individu untuk membentuk helai DNA yang jelas. Helai yang baru diperoleh adalah gambar cermin (bahan pelengkap) dari bahan permulaan yang asal.
- Penyelesaian penyangga: Tindak balas rantai polimerase berlaku dalam larutan penimbal fisiologi. Ini memastikan keadaan serupa dengan yang terdapat pada sel manusia. Penyelesaian ini menjaga pH stabil dan juga mengandungi ion magnesium. Keadaan terkawal ini diperlukan untuk memastikan fungsi polimerase DNA.
- Primer: Mereka terdiri daripada 16 hingga 24 pasangan asas dan berfungsi sebagai posisi permulaan dan isyarat permulaan. Primer menunjukkan DNA polimerase di mana (dari DNA permulaan) proses penyalinan bermula.
Bagaimana ujian PCR dilakukan?
Oleh kerana semua bahan yang diperlukan untuk PCR kini ada di dalam kapal reaksi, proses penyalinan sebenar bahan genetik dapat dimulakan. Ini hanya dimulakan, dikawal dan dihentikan lagi oleh suhu.
Kapal reaksi seterusnya dipanaskan atau disejukkan dengan cara yang disasarkan kepada suhu yang berbeza. Ini dilakukan dengan peranti khas - apa yang disebut pemanas haba. Keseluruhan reaksi mengambil masa sekitar satu hingga dua jam.
Langkah-langkah individu kitaran PCR adalah:
- Denaturasi untaian ganda DNA: Sampel dipanaskan hingga sekitar 90 darjah Celsius. Akibatnya, untai ganda DNA asal dipecah menjadi dua helai tunggal (pelengkap) terpisah.
- Lekapan primer: Suhu diturunkan hingga sedikit di bawah 60 darjah Celsius. Akibatnya, primer (primer depan, primer terbalik) melekat pada kedudukan yang ditentukan pada helai tunggal DNA yang sesuai.
- Sambungan: Suhu dinaikkan hingga sedikit melebihi 70 darjah Celsius. Polimerase DNA kini memulakan kerjanya pada suhu ini secara optimum. Ia melekat pada kedudukan primer dan memanjangkan helai tunggal DNA asal selangkah demi selangkah sehingga salinan tepat (pelengkap) tersedia (sintesis DNA).
Setelah kitaran selesai, suhunya dinaikkan lagi hingga sekitar 90 darjah Celsius - kitaran bermula dari awal lagi.
Dengan menggunakan kaedah PCR, urutan DNA dapat ditiru hingga sekitar tiga pasang kilobase (kbp). Ini sesuai dengan sekitar 3.000 blok asas DNA yang dihubungkan untuk membentuk "rantai". Sebagai perbandingan: genom manusia menyimpan cetak biru dan maklumat untuk operasi sel dalam kira-kira tiga bilion pasangan asas - genom coronavirus, sebaliknya, terdiri daripada 30,000 pasangan asas. Ujian PCR hanya dapat digunakan untuk menghasilkan semula dan memeriksa bahagian pendek dari keseluruhan DNA.
Primer sangat penting
Pemilihan primer sangat penting untuk proses PCR. Dalam diagnostik Sars-CoV-2, misalnya, beberapa primer digunakan (multiplex PCR).
Ujian PCR Corona mencari tiga gen virus yang berbeza: Kekhususan keseluruhan meningkat kepada hampir 99.99%. Ini bermaksud bahawa dengan kadar hit tinggi ini, hanya ada satu ujian positif palsu bagi setiap 10,000 peperiksaan (jika sampel diambil dengan betul).
Berapa banyak bahan genetik yang disalin sekarang?
Mari kita anggap bahawa selepas kitaran pertama terdapat dua helai ganda DNA yang serupa.
Selepas setiap kitaran, jumlah bahan genetik (disalin) meningkat dua kali ganda. Jadi jumlah DNA tumbuh secara eksponen.
Dengan kata lain: selepas kitaran kedua terdapat empat helai ganda yang serupa - selepas kitaran ketiga lapan helai ganda - selepas kitaran keempat 16 helai ganda dan setelah kitaran kelima sudah 32 helai ganda.
Profesional perubatan biasanya mengulangi proses ini sekitar dua puluh hingga tiga puluh kali.
Secara kiasan, ini bermaksud: Sekalipun hanya terdapat satu helai ganda DNA dalam sampel pada awalnya, setelah dua puluh kitaran sudah ada satu juta salinan yang sama di dalam kapal reaksi.
Apakah maksud nilai Ct?
Jumlah kitaran PCR yang lengkap diberikan dalam bentuk nilai Ct yang disebut. "Ct" berasal dari istilah Inggeris "cycle threshold". Nilai Ct ini membolehkan penyataan dibuat mengenai jumlah bahan genetik yang dicari.
Pada nilai Ct 20 yang rendah, terdapat banyak bahan genetik permulaan. Walau bagaimanapun, jika nilai Ct tinggi - sekitar 30 kitaran - terdapat sedikit DNA. Oleh itu kitaran PCR mesti dijalankan lebih kerap.
Langkah 2: Elektroforesis "Menyusun mengikut Saiz"
Akhirnya, jika ada bahan genetik "diperkaya" yang mencukupi, apa yang dikenali sebagai elektroforesis dapat terjadi. Para saintis menggunakan sifat DNA tertentu: cas elektriknya.
Blok binaan DNA individu dihubungkan satu sama lain melalui tulang belakang gula-fosfat (negatif). Semakin lama urutan DNA tertentu, semakin tinggi cas elektriknya.
Sekiranya bahan genetik diletakkan dalam medium pembawa tertentu (agarosa) dan voltan elektrik dikenakan, segmen DNA mula bergerak kerana casnya. Oleh kerana bentangan DNA yang lebih panjang bergerak lebih cepat daripada serpihan yang lebih pendek, mereka memisahkan mengikut ukuran.
Dengan cara ini, bahan genetik dapat diperiksa dan dicirikan. Dalam praktiknya, sampel yang tidak diketahui dengan rujukan yang diketahui biasanya diterapkan pada "garis permulaan" dan dibandingkan satu sama lain setelah jangka waktu tertentu.
Sekiranya "kelajuan migrasi" sama untuk kedua-dua urutan, ini bermaksud: Pengesanannya sangat positif - gen yang anda cari terkandung dalam sampel.
Kes khas Coronavirus: penyediaan sampel dan RT-PCR
Pengesanan patogen untuk coronavirus adalah kes khas.Sars-CoV-2 adalah salah satu yang disebut virus RNA. Ini bermaksud bahawa genom Sars-CoV-2 adalah dalam bentuk RNA (asid ribonukleat).
RNA berbeza dengan DNA hanya dalam beberapa cara. Antara lain, ia boleh didapati sebagai helai tunggal dan berdasarkan gula ribosa dan bukannya 2 "deoxyribose. Timin nukleobase juga telah digantikan oleh uracil sebagai asas keempat.
RNA virus ini mesti "ditranskripsikan" ke dalam DNA sebelum ujian PCR biasa. Proses ini dipanggil transkripsi terbalik (RT) - oleh itu istilah RT-PCR. Dalam proses ini, helai cDNA tunggal ("DNA pelengkap") diperoleh. Pada langkah selanjutnya, helai cDNA tunggal ditambah dengan helai DNA cermin terbalik kedua.
Pada akhir persiapan sampel, terdapat untai ganda DNA yang sesuai dengan cetak biru virus RNA: Hanya helai ganda ini sekarang dapat digunakan sebagai templat dalam ujian PCR.
Berapa lama masa yang diperlukan untuk mendapatkan hasilnya?
Setelah menghantar sampel ke makmal, anda biasanya akan menerima hasilnya setelah satu atau dua hari bekerja.Di pusat ujian, yang sering memeriksa sampel di lokasi, ini hanya memerlukan beberapa jam. Tempoh masa banyak bergantung pada pusat ujian dan logistiknya.
Walaupun proses kerja yang rumit, makmal moden dapat menjalankan ujian PCR dengan throughput yang tinggi. Peranti automatik khas membantu pelaksanaannya.
Ujian PCR masih dianggap agak "lambat" tetapi semua kaedah pengesanan yang lebih dipercayai.
Apa yang berlaku sekiranya hasilnya positif?
Sekiranya sampel diambil dengan betul, ujian PCR positif bermaksud bahawa orang yang diuji kemungkinan besar dijangkiti Sars-CoV-2.
Sekiranya anda disahkan dijangkiti coronavirus dengan bantuan ujian PCR, jabatan kesihatan akan menerima mesej dari makmal masing-masing mengenai hasil ujian positif. Dalam kes sedemikian, jabatan kesihatan akan memerintahkan pengasingan atau karantina.
Adakah saya secara automatik berjangkit sekiranya mendapat ujian PCR positif?
Sebilangan besar masa ya. Tetapi tidak selalu. Hasil ujian PCR harus selalu ditafsirkan mengikut konteks. Ujian positif terutamanya bermaksud bahawa anda mempunyai bahan viral dalam diri anda.
Sekiranya anda baru sahaja menderita Covid 19 (beberapa hari), ujian PCR tetap positif - walaupun anda sudah sihat semula. Ini adalah kes khas dan kelemahan ujian yang sangat sensitif, kerana ia juga dapat mengesan serpihan virus yang tidak dapat membiak.
Ujian antibodi tambahan kadang-kadang berguna
Dalam kes sedemikian, ujian antibodi memberikan kepastian yang memastikan kesahihan ujian PCR. Lebih baik membincangkannya dengan doktor anda. Mereka dapat membantu anda mentafsirkan keputusan ujian PCR dengan betul.
Apa yang perlu dilakukan sekiranya hasilnya negatif
Hasil ujian PCR negatif bermaksud dengan kebarangkalian tinggi bahawa anda tidak mengontrak Covid-19 ketika sampel diambil dan oleh itu tidak menular pada masa ini. Namun, anda mungkin berada pada tahap awal jangkitan.
Biasanya, jangkitan korona hanya dapat dikesan dari hari kedua atau ketiga selepas jangkitan. Jadi hasilnya bukan tiket percuma. Oleh itu, anda harus terus mematuhi peraturan jarak dan kebersihan dan terus memakai topeng FFP2 - untuk diri sendiri dan untuk perlindungan orang lain.
Ujian PCR pada kanak-kanak
Ujian PCR pediatrik tidak berbeza dengan ujian PCR dewasa. Persampelan dan penafsiran hasilnya berlaku untuk kanak-kanak dan orang dewasa.
Apakah risiko ujian PCR?
Ujian PCR tidak menimbulkan risiko fizikal. Hanya pengambilan sampel oleh nasofaring yang dianggap menjengkelkan atau tidak menyenangkan oleh sesetengah orang.
Berapa kos ujian PCR?
Segala kos yang dikenakan untuk ujian PCR akan ditanggung sekiranya doktor yang merawat atau jabatan kesihatan anda menyetujui ujian tersebut. Penggantian kos biasanya dipertimbangkan jika anda sudah mempunyai simptom anda sendiri atau anda pernah berhubung secara langsung dengan orang yang dijangkiti.
Walaupun ujian positif atau ujian kendiri positif, anda berhak mendapat ujian PCR percuma.
Harap maklum: Sekiranya anda telah menguji diri di rumah dan mendapat keputusan positif, anda harus membuat janji temu dengan doktor keluarga anda dengan segera melalui telefon. Doktor anda yang hadir akan membincangkan prosedur selanjutnya dengan anda melalui telefon.
Sebagai alternatif, lebih baik menghubungi 116 117 untuk mendaftar ujian PCR. Sehingga ujian pengesahan, anda semestinya tinggal di rumah untuk melindungi diri dan orang lain.
